Музей был основан в 1920 году на месте закрытого Новоиерусалимского монастыря. Ядро коллекции сложилось в результате национализации усадебных и частных собраний. В течение 1920-х годов с целью вывоза в госфонды картин, художественной мебели, фарфора и прочих ценностей были обследованы расположенные близ Истры имения русской аристократии: Ильинское (вел. кн. С.А.Романова), Петровское (Голицыных), Никольское (Гагариных), Глебово (Брусиловых), Рождествено (Толстых). В конце 1920-х живописные полотна, усадебная мебель и фарфор были переданы в «Новый Иерусалим» из закрытых подмосковных музеев-усадеб Никольское-Урюпино и Дубровицы. До 1937 года Истринский музей пополнил свои фонды за счет 16 бывших имений.

Особенности формирования коллекции позволили большую часть выставки в Третьяковской галерее посвятить русской усадебной культуре XVIII–XIX столетий. Среди привезенных шедевров – работы Ф.С.Рокотова, В.А.Тропинина, Н.Г.Чернецова, а также уникальный портрет XVIII столетия работы Ивана Локтева – возможно, изображение его учителя, первого русского жанриста Ивана Фирсова. Одно из центральных мест в экспозиции занимает «Портрет княжны Смарагды (Марии) Кантемир» кисти И.Н.Никитина, поступивший в 1937 году из Ленинского краеведческого музея в Царицыно.
В состав выставки включены лучшие приобретения 1970–1980-х годов: картины Н.И.Аргунова, М.Н.Воробьева, акварели К.А.Горбунова, П.Ф.Соколова.
В разделе декоративно-прикладного искусства представлены стол-консоль красного дерева, выполненный в начале XIX века по эскизам А.Н.Воронихина, и фарфор двух знаменитых российских предприятий – Императорского фарфорового завода и завода А.Г.Попова.
Особый раздел экспозиции составляют полотна Константина Горбатова (1876–1945) – известного в предреволюционной России пейзажиста, уехавшего из России в 1922 году. Истринский музей хранит большую коллекцию его картин и архив, переданные по завещанию художника в СССР из Берлина в 1964 году.

Выставка в Третьяковской галерее позволяет показать и лучшее из собрания живописи первой половины XX века, которое активно формируется в «Новом Иерусалиме» с 1977 года. В этом ряду один из шедевров Леонида Пастернака – портрет А.Б.Высоцкой-Готц, чьей дочери Борис Пастернак посвятил стихотворение «Марбург». Небольшой, но яркий раздел искусства русского авангарда и неофициального искусства 1920–1930-х годов включает работы выдающихся мастеров – таких, как Р.Р.Фальк, А.А.Осмеркин, А.В.Шевченко, А.Н.Волков, А.Ф.Софронова, Д.Е.Гуревич.